Aislamiento e identificación de hongos asociados a Ilex paraguariensis St. Hil.
Isolation
and identification of fungi associated with Ilex
paraguariensis St. Hil.
López,
Ana C.1,*; Alvarenga, Adriana E.1; Zapata, Pedro D.
1; Luna, María F.2; Villalba, Laura L. 1
1- Laboratorio de Biotecnología Molecular, Instituto
de Biotecnología Misiones, Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales,
UNaM, CP3300, Posadas, Misiones, Argentina.
2- Centro de Investigación y
Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI), CCT-La Plata CONICET, CIC-PBA,
Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de
La Plata, La Plata, Argentina.
* E-mail: anaclara_lopez@yahoo.com.ar
Recibido el 19 de Marzo de 2019, Aprobado el 05 de
Marzo de 2020.
Resumen
El
cultivo de Ilex paraguariensis es
importante en el norte de Argentina, principalmente en la provincia de
Misiones. En los últimos años se ha observado la presencia de diferentes
síntomas de enfermedades causadas por hongos de los cuales no se conoce agente
causal, epidemiología y daño económico. En este estudio, se aislaron hongos de
hojas de yerba mate que presentaban síntomas visibles de lesiones foliares. Cinco
aislados (Alternaria,
Colletotrichum, Phoma y Pilidium) fueron
seleccionados por sus características micro y macromorfológicas. Estos hongos
fueron identificados utilizando un microscopio óptico y claves morfológicas. Se
realizaron ensayos de patogenicidad en hojas y en plantas de un año de yerba
mate. Los resultados mostraron que Colletotrichum sp. LBM 183 y Phoma
sp. LBM 207 son patógenos de hoja de yerba mate capaces de desarrollarse en
el tejido. Mientras que Alternaria sp. LBM 186 y Pilidium sp. LBM
208 fueron capaces de enfermar la planta ingresando por la raíz de yerba mate.
Palabras claves: Yerba mate; Fitopatógenos; Identificación;
Claves morfológicas; Ensayos de patogenicidad.
Abstract
The cultivation of Ilex
paraguariensis is important in northern Argentina, mainly in Misiones
province. The presence of different symptoms of diseases caused by fungi has
recently been observed. Neither the causative agents nor the epidemiological or
economic damages have been identified yet. In this study, fungi were isolated
from yerba mate leaves that showed
visible symptoms of foliar lesions. Five isolated samples: Alternaria, Colletotrichum,
Phoma and Pilidium; which were selected because of both, their micro and
macro morphological characteristics. These fungi were identified by using an
optical microscope together with morphological keys. Pathogenicity tests were
carried out on yerba mate leaves and
on one-year-old plants. The results showed that Colletotrichum
sp. LBM 183 and Phoma sp. LBM 207 are pathogens typical of the yerba mate leaves capable of developing
within the plant tissue, while Alternaria sp. LBM 186 and Pilidium
sp. LBM 208 were able to sicken the plant by entering into the yerba mate root.
Keywords: Yerba mate; Phytopathogens; Identification;
Morphological keys; Pathogenic assay.
Introducción
La
yerba mate (Ilex paraguariensis St.
Hil.) es una especie que se encuentra en bosques lluviosos en el suroeste de
Paraguay, sur de Brasil y norte de Argentina (1). Este árbol es un cultivo
regional muy valioso ya que sus hojas se transforman en una bebida tradicional
llamada mate (2). Actualmente, en nuestro país existen 169.633 hectáreas
cultivadas de yerba mate (3) de las cuales un 87% se encuentran en la provincia
de Misiones, Argentina. En las últimas décadas, un creciente aumento del área
de cultivo genera una serie de problemas fitosanitarios por el aumento de la
disponibilidad de hospederos, manejo y cultivo de las plantas, prácticas
inadecuadas, aumento del estrés fisiológico por los bajos niveles de
sombramiento y abundancia del cultivo en áreas inadecuadas.
Si
bien la República Argentina es la primera productora mundial de yerba mate, los
estudios de patologías afectando al cultivo son escasos (4). En la última
década, se ha observado la presencia de distintos síntomas de enfermedades en
las plantaciones de yerba mate de esta región, de las que no se conoce el
agente causal, epidemiología y potencial de daño económico (5). La información
obtenida de la literatura sobre hongos de yerba mate, revelan más de 120
especies registradas en trabajos científicos publicados en un período entre
1908 y 2002, pero mucho de estos trabajos tienen como objetivo la descripción
taxonómica, sin profundizar en estudios de patogenicidad (Colombo 2002). Uno de
los problemas que afecta la productividad de los cultivos, es la infección foliar
por hongos fitopatógenos. Entre los numerosos hongos que se asocian de
distintas formas al follaje de yerba mate solo unos pocos causan verdaderos
daños y preocupación a los productores yerbateros. Se destacan los causantes de
Antracnosis (Colletotrichum spp.), del Hollín de la yerba mate (Asterina
sphaerelloides); de la Mancha Negra (Cylindrocladium spathulatum),
de Mancha gris o cercosporiosis (Pseudocercospora mate), además de
algunas virosis (3).
En
el proceso de “domesticación” de la yerba, se van sumando los efectos de las
técnicas
culturales (densidad, distanciamiento, labores, fertilización) y la erosión
genética de las características de resistencia que las plantas poseían
creciendo en su ambiente natural. La tendencia a la homogeneidad en ambos
aspectos favorece el desarrollo de enfermedades. En el ambiente selvático, la
acción de las enfermedades es contrarrestada por el ecosistema natural. En un
ambiente agrícola, como el hospedante es abundante y homogéneo y la
biodiversidad pequeña, los enemigos naturales son pocos para equilibrar las
poblaciones de hongos y bacterias patógenas. Esto hace pensar que los problemas
por enfermedades se agudizarán en el futuro (Burtnik 2006).
Por
lo expuesto, es importante profundizar en el conocimiento a los productores
principalmente de las posibles amenazas patógenas que afectan estos cultivos,
ya que existen pocos reportes sobre este tema. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo fue aislar e identificar hongos causantes de síntomas visibles
en hojas de yerba mate. La identificación realizada se llevó a cabo utilizando
técnicas macro y microscópicas. Una vez identificados los aislados, el
siguiente objetivo del trabajo fue realizar pruebas de patogenicidad in vitro en hojas de yerba mate sanas en
cámara húmeda e in vivo en plantas
juveniles de yerba mate. En base a los resultados obtenidos y la bibliografía
disponible se determinó si estos aislados podrían ser potenciales patógenos de
yerba mate o no.
Materiales y métodos
Recolección de material
vegetal
Se seleccionaron muestras de hojas de plantas
de yerba mate con síntomas visibles de enfermedad (Figura 1 A y B). La
recolección se llevó a cabo en el vivero propiedad de la Fundación Alberto
Roth, Santo Pipó, Misiones, Argentina, localización geográfica: 27°08′24″S
55°24′31″O (Figura 2).
Figura 1. Muestras recolectadas de hojas con
síntomas.
Figura 2. Santo Pipó, Misiones, Argentina.
Localización geográfica: 27°08′24″S 55°24′31″O (7).
Aislamiento de endófitos
de yerba mate
Las
hojas se cortaron en pequeños trozos de 1 cm por 1 cm representando tanto las
partes de la hoja con síntomas de infección como partes del tejido sano. Luego,
se realizó un protocolo de desinfección, el cual consistió en un lavado con hipoclorito
de sodio al 2 % v/v durante 3 minutos y 3 lavados con agua destilada estéril
durante 2 minutos. Las muestras se colocaron en placas de Petri con medio
agar-agua al 2 % p/v (AA 2%) y se incubaron a 28±1°C con luz constante, hasta
la visualización de colonias fúngicas.
Identificación de los endófitos aislados
Los
aislados se desarrollaron a 28±1°C en presencia de luz constante en
papa-dextrosa agar (PDA) para inducir la formación de estructuras reproductivas.
Luego de 5 días de incubación, se registraron características macroscópicas
como color de anverso y reverso de la colonia. A su vez, las placas fueron
observadas a simple vista bajo lupa.
Se
realizaron montajes de micelio crecido de las colonias en portaobjetos y se
realizó una tinción con azul de lactofenol para la observación en el
microscopio óptico. Se realizó la observación de diferentes estructuras en el
microscopio junto con la utilización de diferentes claves taxonómicas como las
de Barnett & Hunter (8) y Pitt & Hockings (9).
Ensayos de patogenicidad in
vitro
Para
evaluar la patogenicidad de los hongos aislados de hojas de yerba mate, se
recolectaron hojas sanas de plantas de yerba mate de doce meses de vida. Las
hojas se desinfectaron realizando lavados con hipoclorito de sodio al 2%
durante 2 minutos y 3 lavados sucesivos con agua destilada estéril. Luego, se
dejaron secar y se colocaron con la cara abaxial hacia arriba en bandejas plásticas
previamente desinfectadas con alcohol 70%. Se les realizó un pequeño corte con
bisturí estéril a ambos lados del nervo de la hoja y sobre cada corte se colocó
1 taco de 6 mm con micelio en desarrollo de los aislados seleccionados. El
control consistió en hojas desinfectadas con cortes sin agregado de tacos. Las
hojas se cubrieron con gasa estéril humedecida con agua destilada estéril y las
bandejas se sellaron con parafilm. Se incubaron a 28±1°C durante 7 días en
presencia de luz. Para este ensayo, se utilizó un diseño aleatorizado con seis
tratamientos y tres repeticiones, donde la unidad experimental fue la hoja y la
variable de estudio fue daño ocasionado por el microorganismo en la hoja. El daño
se determinó utilizando una escala arbitraria en comparación a lo observado en
el control. Para corroborar que el daño ocasionado en el tejido vegetal fue
producido por el microorganismo inoculado, se realizó el reaislamiento de los
hongos.
Ensayos de patogenicidad
en plantas de yerba mate
Se
realizó un segundo ensayo de patogenicidad en la raíz de la planta de yerba
para observar si estos aislados son capaces de afectar también este tejido
vegetal. Para este ensayo, se realizó un diseño experimental completamente
aleatorizado con seis tratamientos (cinco aislamientos y un control), y seis
repeticiones donde la unidad experimental fue la planta, de doce meses de vida.
La duración del ensayo fue de 4 meses. Cada planta se inoculó con 5 ml de una
suspensión en Tween 80 al 0,1% de 105 propágulos/ml de los aislados.
El control consistió en el agregado de agua destilada a las plantas. Las
plantas se mantuvieron en cámara de incubación a una temperatura de 24°C
durante el período de luz con una duración de 12 horas y con una intensidad de
alrededor de 2000 Lumex, y una temperatura de 20°C durante el período de
oscuridad con una duración de 12 horas. Al finalizar el ensayo, se realizó peso
seco total, de la raíz y parte aérea de las plantas. También se determinó
incidencia y severidad de las plantas ensayadas.
La
incidencia se determinó utilizando la siguiente fórmula:
(1)
Los
síntomas fueron evaluados según la siguiente tabla:
Tabla 1. Escala de severidad
|
Escala |
Síntoma |
|
0 |
0 a 5% de manchas en parte aérea |
|
1 |
5
a 25% de manchas en la parte aérea |
|
2 |
25 a 50% de manchas en la parte aérea |
|
3 |
>50%
de manchas en la parte aérea |
Análisis estadísticos
Los datos de
peso seco obtenidos en el ensayo de patogenicidad en plantas se probaron para
la distribución normal con la prueba de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de
varianza, dependiendo los resultados, fueron analizados con ANOVA o Kruskal-Wallis.
Se realizó un posterior análisis con la prueba de Fisher con un 5% de confianza
utilizando el programa Statgraphics Centurion XV versión 15.2.06.
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Aislamiento e
identificación de endófitos de yerba mate
Se
realizaron 15 aislamientos de hongos con diferentes características
macroscópicas y microscópicas. Mediante técnicas macro y microscópicas se
lograron identificar 6 aislados, los cuales fueron nombrados según las siglas
de la colección de cultivos del Instituto de Biotecnología Misiones: Colletotrichum sp. LBM
183, Alternaria sp. LBM 186, Phoma sp. LBM 189, Phoma sp. LBM 207 y Pilidium sp.
LBM 208.
Género Colletotrichum
La
cepa LBM 183 se pudo identificar como Colletotrichum
sp. La colonia crecida en PDA a los 7 días presentó micelio de color gris
oscuro en el anverso (Figura 3 A) y color negro en el reverso de la colonia
(Figura 3 B). En la lupa se pudieron observar hifas finas y gruesas y a su vez,
un aglomerado de estructuras (Figura 3 C). En el microscopio utilizando aumento
de 40X se observó aglomerado de hifas hialinas septadas, conidios de gran
tamaño hialinos de forma cilíndrica con extremo redondeado y setas color marrón,
que son característicos del género (Figura 3 D).
Figura 3. Género Colletotrichum. A. Anverso
y B. Reverso de la colonia de LBM 183
crecida en PDA durante 7 días C.
Placa crecida en PDA observada en la lupa D.
Observación en microscopio con aumento 40X, flecha amarilla señala los conidios
y flecha roja hace referencia a la seta observada
Género Alternaria
La
cepa LBM 186 fue identificada como Alternaria
sp. El anverso de la colonia crecida en PDA se observó color marrón claro y de
aspecto algodonoso (Figura 4 A), mientras que el reverso se observó marrón
oscuro en el centro de la colonia y marrón más claro hacia el borde de la placa
(Figura 4 B). En la lupa se observaron cadenas y agrupaciones de conidios
(Figura 4 C) que luego se observaron al microscopio óptico, donde se pudo
determinar la disposición de 3 a 5 conidios en cadena. Los conidios presentaron
forma ovoide con 6 o más septos en su interior e hifas hialinas septadas
(Figura 4 D).
Figura 4. Género Alternaria. A. Anverso y
B. Reverso de la colonia de LBM186
crecida en PDA durante 7 días C.
Placa crecida en PDA durante 7 días observada en la lupa D. Foto de microscopía con aumento 40X
Género Phoma
Las
cepas LBM 187 y LBM 207 fueron identificadas como Phoma sp. La colonia de lado anverso de LBM 187 presentó color
marrón claro en el centro y blanco hacia los bordes con aspecto algodonoso
(Figura 5 A), mientras que el reverso se caracterizó por presentar un color
verde oscuro casi negro (Figura 5 B). El anverso de la colonia de LBM 207
presentó un color rosado (Figura 5 C), mientras que el reverso se observó de
color marrón con la formación de anillos concéntricos alrededor del centro de
la colonia (Figura 5 D). Las colonias de ambas cepas observadas bajo la lupa
presentaron estructuras globosas (Figura 5 E) que mediante observación
microscópica se determinó que esas estructuras corresponden a picnidios
característicos del género Phoma
(Figura 5 F). También se observó la presencia de conidios unicelulares e hifas
hialinas estériles característicos de este género.
Figura 5. Género Phoma. A. Anverso y B. Reverso de la colonia de LBM 189 crecida en
PDA durante 7 días C. Anverso y D. Reverso de la colonia de LBM 207 crecida en
PDA durante 7 días E. Placa crecida en PDA durante 7 días observada en la lupa F.
Foto de microscopía con aumento 10X, las flechas indican la presencia de
picnidios.
Género Pilidium
La
cepa LBM 208 fue identificada como Pilidium
sp. La colonia presentó color blanco del lado anverso (Figura 6 A) y color
amarillento del reverso (Figura 6 B) luego de 7 días de incubación en PDA. Esta
cepa se caracterizó por ser de crecimiento lento, ya que a los 12 días de desarrollada
la colonia en PDA se observó, tanto del lado anverso como reverso, una pigmentación
color marrón con formación de círculos concéntricos y formación de picnidios
(Figura 6 C). En el microscopio, se observaron hifas hialinas estériles luego
de 7 días de incubación en PDA; en cambio, luego de 12 días de incubación en
PDA, se pudieron observar pequeñas conidias fusiformes con extremos puntiagudos
aglomeradas en masa (Figura 6 D).
Figura 6. Género Pilidium. A. Anverso y B. Reverso de la colonia de LBM 208 crecida
en PDA durante 7 días C. Reverso de la colonia de LBM208 crecida en PDA durante
12 días D. Foto de microscopía con aumento 40X de la colonia crecida durante 12
días en PDA.
Ensayos de patogenicidad in vitro en cámara húmeda
En
el ensayo realizado en cámara húmeda se pudo observar que el aislamiento que
mayor severidad produjo en el tejido de la hoja en comparación con el control (Figura
7 A) fue Phoma sp. LBM 207 (Figura 7 F).
Se pudo observar que este aislado produjo una mancha necrótica en el tejido de
la hoja. Colletotrichum sp LBM 183 y Alternaria sp. LBM 186 fueron capaces de
dañar la hoja en menor proporción que LBM 207 (Figura 7 B y D), mientras que LBM
189 Phoma sp. y LBM 208 Pilidium sp. (Figura 7 E y G) fueron los
que menor daño causaron a la hoja en comparación con el control.
Figura 7. Ensayo de patogenicidad. Fotografías de
hojas de yerba mate luego de 7 días de incubación a 28°C. A. Hoja sin inóculo:
control. Hojas inoculadas con: B. Colletotrichum
sp. LBM 183. C. Alternaria sp. LBM 186
D. Phoma sp. LBM 189 E. Phoma sp. LBM 207. F. Pilidium sp. LBM 208.
En
las hojas inoculadas con los diferentes aislados, se pudo observar la presencia
de estructuras reproductivas de LBM 183, LBM 186, LBM 207 y LBM 208 mediante
observación al microscopio óptico (Figura 8). Esto nos da un indicio de que el
hongo fue capaz de reproducirse en el tejido vegetal en las condiciones
ensayadas.
Figura 8. Fotografías tomadas de hojas inoculadas
observadas en el microscopio óptico. A. Flecha roja y flecha verde indica setas
y conidios, respectivamente, de Colletotrichum
sp. LBM 183 en 10X B. Conidio de Alternaria
sp. LBM 186 cerca de la hoja en 40X C. Flechas rojas indican picnidios de Phoma sp. LBM 207 formado en la hoja en 40X
D. Flechas roja y verde indican picnidio y conidias, respectivamente, de Pilidium sp LBM 208 en 40X.
En
el trabajo publicado por Rybak (5) se reporta a Phoma sp. como un patógeno de hojas de yerba mate en donde se muestran
estructuras reproductivas similares a las observadas en la Figura 9 C, por lo
que podemos decir, que Phoma sp. LBM
207 es capaz de reproducirse y desarrollarse en la hoja, ocasionándole un daño
visible al tejido. Por otro lado, Gomes (16) en su trabajo ha logrado asociar
la antracnosis de la yerba mate a organismos de la especie Colletotrichum acutatum, donde existe una prevalencia de la
infección en hojas jóvenes. Por lo expuesto, podemos afirmar que Colletotrichum sp. LBM 183 y Phoma
sp. LBM 207 son patógenos de hoja de yerba mate.
Para
poder obtener un mejor diagnóstico sobre estos posibles patógenos, se debería
realizar un ensayo bajo las mismas condiciones, pero con mayor duración de
tiempo, para que el hongo tenga tiempo para poder desarrollarse y sea capaz de
infectar el tejido.
Ensayos de patogenicidad en plantas de
yerba mate
Todas
las cepas inoculadas mostraron una incidencia del 50% o mayor en plantas de
yerba mate. Se observó un índice de síntomas de 1, es decir, 5 a 25% de manchas
en las hojas, en las plantas tratadas con Alternaria
sp. LBM 186 y Phoma sp. LBM 189. Las
plantas tratadas con las otras cepas mostraron un índice de síntomas de 2, por
lo cual se observaron de un 25% a un 50% de manchas en las hojas de las plantas
(Tabla 2).
Tabla 2. Incidencia y síntomas de las plantas de
yerba en presencia de los diferentes hongos inoculados.
|
Cepa |
Género |
Repeticiones |
Incidencia (%) |
Severidad |
|
LBM183 |
Colletotrichum sp. |
6 |
66,7 ± 0,52 |
2 |
|
LBM186 |
Alternaria sp. |
6 |
50
± 0,55 |
1 |
|
LBM189 |
Phoma sp. |
6 |
66,7 ± 0,52 |
1 |
|
LBM207 |
Phoma sp. |
6 |
66,7
± 0,52 |
2 |
|
LBM208 |
Pilidium sp. |
6 |
66,7 ± 0,52 |
2 |
Los
resultados de los pesos secos de las plantas mostraron que Alternaria sp. LBM 186 fue la única cepa capaz de disminuir el peso
total, de raíz y parte aérea de la planta con diferencias significativas en
comparación con el control (peso total p = 0,0003; peso seco raíz p= 0,0043;
peso seco parte aérea p = 0,013). Phoma
sp. LBM 207 mostró diferencias significativas con el control de menor peso seco
total y de raíz. Las demás cepas utilizadas no disminuyeron el peso seco de las
plantas en comparación con el control (Figura 9).
Figura 9. Promedio de peso seco del ensayo de
patogenicidad en plantas. Las letras iguales arriba de las barras indican
grupos homogéneos. Referencias: Colletotrichum sp. LBM 183, Alternaria
sp. LBM 186, Phoma sp. LBM 189, Phoma sp. LBM 207 y Pillidium sp. LBM 208.
Estos
resultados demostraron la capacidad de Alternaria
sp. y Pilidium sp. de afectar el
tejido vegetal de las plantas de yerba inoculadas. No se observaron mayores
daños cuando se inocularon en la hoja de yerba mate, por lo que podemos suponer
que dichos hongos probablemente sean endófitos de hojas de yerba mate viviendo
saprófitamente.
Por
el momento, no se han encontrado trabajos que indiquen a Alternaria sp.
y Pillidium sp. como posibles patógenos de yerba mate, pero sí, se han
encontrado investigaciones que reportan a estos géneros como patógenos de una
amplia variedad de cultivos tanto en hoja como en raíz. Especies del género Alternaria
han sido reportadas como patógenos de una vasta cantidad de cultivos
destinados a la alimentación humana, como patógenos de tomate (10), trigo y
sorgo (11), entre otros. Se registró la presencia de hongos del género Alternaria en suelos donde se realizan monocultivos
de yerba mate (12). Se ha reportado la aparición de este género como endófitos
en un cultivo que se desarrolla bajo las mismas condiciones y con
características fisiológicas muy similares a las de yerba mate, como es el té Camellia sinensis (13). Las especies del
género Pilidium son han sido reportadas como agente causal de manchas
foliares en plantas de frutilla (14), así como también se ha detectado casos de
pudrición de la fruta en cultivares de pera (15) y en otros frutos. Pero no se
han encontrado trabajos que asocien este hongo a enfermedades en cultivos de Ilex paraguariensis.
Por
lo expuesto, Alternaria sp. LBM 186 y
Pilidium sp. LBM 208 son potenciales patógenos
de yerba mate capaces de ingresar por la raíz de la planta y afectando
sistemáticamente dicho cultivo produciendo daños con síntomas visibles. Para
corroborar la patogenicidad de estos géneros, se debería realizar pruebas de
patogenicidad en plantas de yerba mate con inoculaciones del hongo en estudio
en el órgano vegetal del que fueron aislados.
CONCLUSIONES
Phoma sp. LBM 207 y Colletotrichum sp. LBM 183 fueron capaces de producir signos en las
hojas de yerba mate, por lo que son potenciales patógenos de hoja de yerba
mate. Alternaria sp. LBM 186 y Pilidium sp. LBM 208 son reportados por
primera vez como potenciales patógenos de yerba mate.
Este
trabajo es de gran importancia regional ya que se centra en un problema de gran
relevancia que afecta a la producción yerbatera. La infección de yerbales por
fitopatógenos produce grandes pérdidas en la productividad, por lo que conocer
el agente causal y las condiciones en las cuales se produce nos lleva a poder
desarrollar herramientas que permitan el manejo y control de estos patógenos.
AGRADECIMIENTOS
Los
autores de este trabajo agradecemos a quienes financiaron esta investigación a
través de un proyecto de innovación “Universidades
Agregando Valor 2017” brindado por Secretaría de Políticas
Universitarias Resolución N°4285-APN-SECPU#ME/17
y el proyecto PICT-START UP 2017-0007 otorgado por la Agencia Nacional de
Promoción Científica y Tecnológica. También agradecemos a la Fundación Alberto
Roth por proveer los ejemplares para la realización de los ensayos.
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