Dra. María Lorena Castrillo Imprimir

Título: AISLAMIENTOS DE TRICHODERMA, NATIVOS DE LA PROVINCIA DE CARACTERIZACIÓN DE CELULASAS SECRETADAS POR MISIONES (ARGENTINA) APLICABLES EN LA ETAPA DE SACARIFICACIÓN

Autora: Lic. María Lorena CASTRILLO

Resumen:
La bioconversión de biomasa lignocelulósica en azúcares monoméricos, mediante la acción de enzimas celulasas, es la etapa más lenta y costosa del proceso de obtención de biocombustibles de 2da generación, y se convierte en la principal dificultad económica que obstaculiza el aprovechamiento rentable de esta abundante fuente de energía. Misiones es una región muy biodiversa y favorable para la búsqueda de nuevos microorganismos fúngicos. El género Trichoderma, es uno de los mejores secretores de celulasas. Aislar y caracterizar nuevos aislados microbianos nativos capaces de secretar celulasas con alto rendimiento, como también conocer sus características bioquímicas y moleculares, aportarían soluciones innovadoras para la aplicación de esta tecnología. Atendiendo a esta necesidad, el OBJETIVO GENERAL del presente proyecto fue caracterizar bioquímica y molecularmente nuevos sistemas enzimáticos hidrolíticos a partir de aislamientos de Trichoderma, nativos de la provincia de Misiones, seleccionados en base a su óptima capacidad de secreción de celulasas para su aplicación en la etapa de sacarificación. Para evaluar la capacidad secretora de celulasas cualitativa y cuantitativamente, se partió de 28 aislamientos de Trichoderma, de los cuales se seleccionaron los tres aislamientos más promisorios. Los aislados se identificaron a nivel de especie mediante la amplificación molecular de la región ITS1-5,8S-ITS2 del ADNr; el aislamiento POS7 se identificó como T. koningiopsis, y los aislamientos NAN13 y TEYU14 se identificaron como T. harzianum. Con el fin de optimizar las variables operativas para la secreción de celulasas utilizando sustratos lignocelulósicos en cultivos SSF, se seleccionaron las fuentes de carbono y nitrógeno a través de un análisis de varianza. Para POS7, la mayor actividad enzimática se detectó con bagazo de caña de azúcar, y para NAN13 y TEYU14, con cascarilla de arroz. Respecto a las fuentes de nitrógeno, el mayor incremento en la actividad enzimática se detectó con el complejo nitrogenado Mandels. Una vez seleccionado el medio Mandels, mediante un diseño de superficie de respuesta (RSM), se optimizaron sus tres principales componentes nitrogenados (urea, extracto de levadura y sulfato de amonio), y mediante un nuevo diseño de RSM, se optimizaron diferentes parámetros físico-químicos (relación masa/volumen, % de humedad y pH del medio). A partir de una metodología de fermentación adecuada y un diseño experimental eficaz, fue posible optimizar la secreción sinérgica del complejo celulasas y particularmente de cada una de las enzimas del mismo. POS7 presentó la máxima secreción de celulasas (en U/L), seguido de TEYU14 y de NAN13. Para evaluar la prospección biotecnológica de las enzimas secretadas, se realizaron ensayos de sacarificación enzimática del material lignocelulósico pretratado bajo diferentes condiciones de pretratamiento químico y diversos tiempos de reacción. Se observó que hubo diferencias significativas entre el control (sin pretratar) y todas las combinaciones de pretratamiento-sacarificación ensayadas. Para bagazo de caña de azúcar, la condición que presentó diferencias significativas frente a las demás, fue el ensayo con NaOH al 3% llevado a 121°C y 1 atm de presión superior a la normal durante 50 min; mientras que para cascarilla de arroz, fueron los ensayos con H2SO4 al 0,42% durante 29 min y al 1,98% durante 71 min, ambos llevados a 121°C y 1 atm de presión superior a la normal. Optimizado el cultivo en SSF, se evaluó la estabilidad de la actividad enzimática post-fermentación en el tiempo, y a diferentes temperaturas y pH de reacción. Se observó notable estabilidad enzimática en el tiempo, pero con pérdidas significativas a T° por debajo y encima de los 50°C, y en menor medida a diferentes pH de reacción. Así mismo, se determinó la presencia de isoenzimas para cada una de las enzimas del complejo celulasas. Finalmente, se buscó obtener un fragmento génico de las enzimas del complejo, mediante el diseño de cebadores degenerados. Para NAN13 la amplificación por PCR permitió obtener un fragmento génico de 372 pb con una identidad máxima del 95% con el gen cbhI de T. harzianum, sirviendo de punto de partida para la obtención de la secuencia génica reguladora y estructural del gen cbh1 en POS7, por tanto estas secuencias pudieron reconocerse como nuevos miembros de las CBHs en aislamientos del género Trichoderma nativos de la provincia de Misiones (Argentina).

Comisión de Supervisión:

  • Dra. Marta Amelia VATTUONE (Universidad Nacional de Tucumán)
  • Dra. Gladis JERKE (FCEQyN - Universidad Nacional de Misiones)
  • Dra. Marina Inés QUIROGA (FCEQyN - Universidad Nacional de Misiones)

Tribunal Evaluador:

  • Dra. Marta Amelia VATTUONE (Universidad Nacional de Tucumán)
  • Dr. Osvaldo DELGADO (CONICET - CCT Tucumán)
  • Dra. María Victoria GARCÍA (Universidad Nacional de Misiones - IBS)

 

 

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